雞蛋過敏的人群為廣泛,國外已經出臺了強制性標識食品過敏原的法規，而國內只有針對出口食品過敏源成分的標準，以實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法和環介導等溫擴增檢測方法為主，需要開發制定高靈敏度的直接對常見致敏蛋白的定性定量方法，并制定相應的標識法規。

　　目前用于過敏原檢測的手段主要有酶聯免疫(ELISA)法、PCR法和液相色譜-質譜聯用技術。ELISA法是基于蛋白質的檢測技術，是現在為成熟的方法，但是由于各種加工手段使蛋白質存在不同程度的變性，導致無法與抗體準確結合，而且ELISA法不可避免存在交叉反應且通量低，因此不適于對雞蛋過敏原的準確定量。PCR法是基于DNA水平的檢測手段，而非直接對致敏蛋白進行定量，但雞蛋含有極少量的DNA，并且雞蛋和雞肉中的DNA沒有差異性。近年來，液相色譜-串聯質譜法廣受關注，其基于特征肽段有效地解決了變性蛋白的定量檢測問題，而且可以直接對蛋清致敏蛋白進行高靈敏度、特異性和準確度的檢測。

　　質譜檢測方法具有高靈敏度與特異性的優勢，可通過超液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)技術建立雞蛋過敏原卵白蛋白的定量檢測方法，并進行線性關系、檢出限、加標回收等方法學驗證，將所建方法應用于實際商品中卵白蛋白的定量檢測，以期對食品中雞蛋過敏原的準確定量提供技術支持。

　　1、特征肽段的篩選

　　首先篩選卵白蛋白中的特征肽段。將前處理后的樣品直接注入Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜進行分離分析，將所得的肽段信息利用ProteinPilot軟件和Uniprot數據庫分析處理。與Uniprot數據庫結果比對后，得到多條肽段。然后根據如下特征肽段的篩選原則進行特征肽段的篩選：以7～20 個氨基酸為宜;不含錯切或漏切的酶切位點;不含甲硫氨酸;具有穩定的物理化學性質;進行定性定量分析時，具有較好的靈敏度和峰形。終篩選到3 段響應值較好、靈敏度較高的特征肽段，分別為LTEWTSSNVMEER(LR-13)、GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)、ELINSWVESQTNGIIR(ER-16)。所選擇的3 條肽段通過Uniprot數據庫進行BLAST搜索，確定肽段的唯yi性。

　　2、流動相及多反應監測參數優化

　　實驗比較了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 種流動相體系在相同的洗脫程序條件下特征肽段的響應和出峰情況。結果表明，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，特征肽段的響應和峰形都要優于前者，拖尾現象明顯改善，穩定性也有所提高。在電噴霧離子源正離子模式下，加入甲酸有助于肽類物質離子化進而提高分離效率和質譜信號的強度，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

　　3、方法的線性關系、LOD和LOQ結果

　　分別精密移取混標儲備液，用水稀釋配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標準溶液，分別以3 條特征肽段的色譜峰面積為縱坐標(Y)，以各組分的質量濃度為橫坐標(X)做線性回歸方程，并計算該方法的線性范圍。

　　4、基質效應的評價

　　基質效應大于100%時，表明基質對目標物離子化有增益作用;基質效應小于100%時，表明基質對目標物離子化有抑制作用。結果表明，餅干(95.05%)、面包(90.68%) 、掛面(88.53%) 對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有不同程度的減弱作用，其中掛面的離子化抑制程度大;而蛋糕基質(112.60%)對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有增益作用。

　　5、加標回收率測定結果

　　卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)在基質餅干1中回收率在83.32%～95.66%之間，相對標準偏差(RSD)不大于9.97%;在基質餅干2中回收率在80.76%～98.55%之間，RSD不大于8.59%; 在基質掛面中回收率在77.22%～92.68%之間，RSD不大于5.13%;在基質蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之間，RSD不大于4.88%;在基質蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之間，RSD不大于8.31%;在基質面包中回收率在85.13%～91.36%之間，RSD不大于6.30%。

　　結論

　　通過蛋白質組學方法成功篩選到高特異性卵白蛋白肽段，并采用電噴霧質譜多反應監測模式實現了高靈敏度、快速定量。該方法的建立為食品中雞蛋過敏原的檢測提供了技術支持，為推動我國食品過敏原標識的監督與立法提供理論支持。